Wpływ fitoncydów na funkcjonowanie układu immunologicznego broilerów kurzych i indyków
Koncicki A., Śmiałek M., Tykałowski B., Pestka D., Stenzel T. Katedra Chorób Ptaków, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie.
Streszczenie
Celem badań było określenie wpływu mieszanki paszowej uzupełniającej dla drobiu w preparacie adiSalmoSOL PF na wybrane elementy odporności komórkowej i humoralnej u kurcząt broilerów i indyków rzeźnych. W doświadczeniu I do badań użyto 50 indyków typu Hybrid Convertet w wieku 5 tyg. i 50 kurcząt broilerów typu Ross w wieku 4 tygodni, które losowo podzielono na dwie grupy po 25 ptaków. Indyki i kurczęta grup 1 stanowiły kontrolę a ptakom grupy 2 podawano przez 3 dni z wodą do picia, w dawce 1 ml na 1 litr wody preparat adiSalmoSOL PF. W doświadczeniu II badano wpływ preparatu andiSalmoSOL PF na poziom przeciwciał po szczepieniu kurcząt broilerów przeciwko wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV, ang. Infectious Bronchitis Virus). W tym celu 23 kurczęta broilery typu Ross w wieku 25 dni (grupa I) otrzymywały przez 3 dni badany preparat przed szczepieniem. Kurczęta grup I, II i III (po 23 ptaki w wieku 28 dni) zaszczepiono przeciwko IBV, przy czym ptaki grupy II otrzymywały badany preparat przez 3 dni po szczepieniu.
U kurcząt broilerów, które otrzymywały badany preparat stwierdzono statystycznie istotnie wyższy odsetek subpopulacji CD4+ limfocytów T izolowanych z migdałków jelit ślepych i śledziony, a CD8+ z grasicy i śledziony oraz CD4+CD8+ z Torby Fabrycjusza i błony śluzowej jelita biodrowego. W błonie śluzowej jelita biodrowego kurcząt grupy badanej stwierdzono także wyższy odsetek subpopulacji IgM+ komórek B. Natomiast u indyków grupy badanej stwierdzono statystycznie istotnie wyższy odsetek subpopulacji CD4+ limfocytów T izolowanych z grasicy i śledziony.
CD8+ izolowanych z migdałków jelit ślepych i krwi oraz CD4+CD8+ izolowanych z grasicy. Nie wykazano różnic statystycznie istotnych między grupą kontrolną a badaną indyków w odsetku subpopulacji IgM+ limfocytów B izolowanych z badanych narządów. Pomimo braku różnic statystycznie istotnych najwyższe miano przeciwciał
stwierdzono w grupie kurcząt, które otrzymywały badany preparat po szczepieniu.
Uzyskane wyniki wskazują, że badany preparat adiSalmoSOL PF stosowany per os przez 3 dni w dawce 1 ml na 1
litr wody wykazuje działanie immunomodulujące u kurcząt broilerów i indyków.
Wstęp
Po wprowadzeniu od 1 stycznia 2006 roku zakazu stosowania antybiotykowych stymulatorów wzrostu, co było podyktowane pogłębiającym się problemem lekooporności drobnoustrojów (1, 2), a także oddziaływaniem immunosupresyjnym niektórych antybiotyków (3) poszukuje się naturalnych alternatyw pozwalających uzyskiwać zadowalające wyniki ekonomiczne chowu drobiu. Alternatywą taką wydają się być fitoncydy – metabolity roślin wyższych, które wykazują działanie pierwotniakobójcze, grzybostatyczne i grzybobójcze, przeciwwirusowe i antybakteryjne (4 – 10). Metabolity roślin wyższych coraz częściej z powodzeniem są stosowane w różnych preparatach na fermach drobiu z uwagi na ich oddziaływanie immunomodulujące. Jest to o tyle istotne, że zdrowotność ptaków utrzymywanych systemem intensywnym, w głównej mierze jest uzależniona od stanu funkcjonalnego ich układu immunologicznego, który decyduje o poziomie odporności poszczepiennej i skuteczności leczenia, gdyż z prawidłową jego funkcją związana jest ostateczna eliminacja drobnoustrojów chorobotwórczych i wytwarzanych przez nie toksyn, stymulacja procesów naprawczych w uszkodzonych tkankach oraz ochrona przed ponownym zakażeniem. Należy przy tym zaznaczyć, że funkcje układu odpornościowego ptaków mogą być upośledzone przez liczne czynniki zarówno natury zakaźnej (11 – 13), jak i niezakaźnej (3, 14 – 16). Wiele patogenów wykazuje szczególne powinowactwo do narządów i komórek układu immunologicznego upośledzając wytwarzanie prekursorów limfocytów, makrofagów i granulocytów oraz rozregulowując metabolizm i funkcje komórek obronnych poprzez blokowanie receptorów cytokin, hamowanie syntezy interferonów, czy choćby zmniejszenie ekspresji cząsteczek MHC na powierzchni zakażonej komórki (17 – 19).
W procesach odpornościowych ptaków istotną rolę odgrywa układ odpornościowy związany z błonami śluzowymi (MALT, ang. Mucosa- associated lymphoid tissue). W przewodzie pokarmowym MALT reprezentowany jest przez struktury immunologiczne błony śluzowej które współtworzą tkankę limfoatyczną błon śluzowych przewodu pokarmowego (GALT, ang. Gut-aasociated lymphoid tissue) (20). Z licznych badań (21 – 25) wynika, że w zjawiskach odpornościowych przewodu pokarmowego dużą rolę odgrywają enterocyty kosmków i krypt jelitowych, które pozostają w stałej kooperacji z limfocytami. Na rozwój tych elementów GALT ma wpływ rodzaj pokarmu i stosowanych dodatków paszowych (20). Te bardzo istotne, z punktu widzenia odpowiedzi immunologicznej, zagadnienia zachodzące w GALT i związanym z nim ogólnym układem odpornościowym ptaków były ispiracją do przeprowadzenia badań nad wpływem fitoncydów stosowanych per os na funkcjonowanie układu odpornościowego kurcząt i indyków.
Celem badań było określenie wpływu podanej per os mieszanki paszowej uzupełniającej w formie płynnej dla drobiu w preparacie adiSalmoSOL PF na wybrane elementy odporności komórkowej i humoralnej u kurcząt broilerów i indyków rzeźnych.
Materiał i metody
Mieszanka paszowa uzupełniająca
Zastosowano preparat adiSalmoSOL PF (AdiFeed® Sp. z.o.o.) zawierający w składzie: dodatki sensoryczne – wyciąg ziół (33,55%), kwas benzoesowy (0,55%), olejek anyżowy (0,55%), salicylan metylu (0,5%), olejek cynamonowy (0,3%), eugenol (izoeugenol) (0,4%), tymol (0,4%), olejek eukaliptusowy (0,3%), olejek czosnkowy/
oleożywica czosnkowa (0,3%), olejek herbaciany (0,27%), olejek gorczycowy (0,22%) i was walerianowy (0,15%) oraz glicerynę i siarczan sodu do 100%.
Układ eksperymentalny
Doświadczenie I
Indyki – eksperyment przeprowadzono na klinicznie zdrowych 50 indykach typu Hybrid Converter w wieku 5 tyg., które losowo podzielono na dwie grupy po 25 ptaków: I – kontrolna i II – doświadczalna (przez 3 dni podawano z wodą do picia adiSalmo- SOL PF w dawce 1 ml na 1 litr wody). kurczęta broilery – do badań użyto 50 kurcząt broilerów typu Ross w wieku 4 tyg., które losowo podzielono na dwie grupy po 25 ptaków: I – kontrolna i II – doświadczalna (przez 3 dni podawano z wodą do picia badany preparat adiSalmoSOL PF w dawce 1 ml na 1 litr wody)
Doświadczenie II
Doświadczenie II przeprowadzono na 69 broilerach kurzych typu Ross, które losowo podzielono na 3 grupy (I, II i III) po 23 ptaki w każdej. Od 25 dnia życia kurczęta grupy I otrzymywały przez 3 dni z wodą do picia adiSalmoSOL PF w dawce 1 ml na 1 litr wody. Wszystkie ptaki z grup I, II i II zaszczepiono przeciwko wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV) w 28 dobie życia. Kurczęta grupy II otrzymywały adiSalmoSOL PF w wymienionej dawce przez 3 dni po szczepieniu. Natomiast grupę III stanowiły ptaki, które nie otrzymywały badanego preparatu na żadnym etapie doświadczenia.
Zarówno indyki, jak i kurczęta od pierwszego dnia życia odchowywano na ściółce w Pawilonie Zakażeń Eksperymentalnych Ptaków Katedry Chorób Ptaków w Olsztynie. Doświadczenia na zwierzętach wykonano za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej ds. doświadczeń na zwierzętach. Przez całe doświadczenie ptaki miały swobodny dostęp do paszy i wody.
Protokół szczepienia
W doświadczeniu II, w 28 dobie życia, kurczęta ze wszystkich grup eksperymentalnych zostały zaszczepione przeciwko IBV szczepionką Cevac® BRON 120L (seria 0810A1SKH, dw 04/2014), którą zastosowano z wodą do picia.
Pobieranie próbek do badań
Próbki krwi do badań cytometrycznych pobierano z żyły skrzydłowej do probówek z antykoagulantem (EDTA K2) po 10 godzinach od zakończenia podawania badanego preparatu od 7 kurcząt broilerów i 7 indyków z każdej grupy (doświadczenie I), z kolei w doświadczeniu II krew do badań serologicznych pobierano od 23 kurcząt broilerów z każdej grupy doświadczalnej, 2 tygodnie po szczepieniu przeciwko IBV, do probówek bez antykoagulantu. Od losowo wybranych ptaków (n=7) z każdej grupy doświadczalnej w ramach eksperymentu I, po eutanazji do dalszych badań pobierano torbę Fabrycjusza (BF, ang. Bursa of Fabricius), grasicę, migdałki jelit ślepych (CTs, ang. cecal tonsills), dziesięcio – centymetrowy dystalny fragment jelita biodrowego oraz śledzionę z których po izolacji komórek mononuklearnych oznaczono procentowy udział subpopulacji CD4+, CD8+ oraz
CD4+/CD8+ limfocytów T oraz IgM+ limfocytów B z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
Analiza serologiczna
Poziom przeciwciał IgY anty-IBV w surowicy kurcząt oznaczono z wykorzystaniem komercyjnego kitu testów ELISA (IDEXX LAboratories, USA). Poszczególne etapy testów wykonane zostały przy użyciu automatycznej stacji pipetującej Eppendorf epMotion 5075 LH, automatycznej płuczki BioTek ELx405 oraz czytnika BioTek ELx800 płytek wielodołkowych.
Izolacja komórek mononuklearnych oraz cytometria przepływowa
Komórki mononuklearne krwi obwodowej (PBMC, ang peripheral blood mononuclear cells) zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (12, 23). Próbki pozostałych narządów zostały indywidualnie zhomogenizowane w 1 ml medium hodowlanego (RPMI-1640, Sigma-Aldrich, Niemcy) z dodatkiem 5% FCS (Fetal Calf Serum, Sigma-Aldrich, Niemcy) z wykorzystaniem autometycznego homogenizatora tkantkowego
(TissueLyser II, Qiagen, Niemcy). Homogenaty narządów zostały przefiltrowane przez sterylne sitka o średnicy oczek 70 μm (BD Falcon, USA). Resztki tkanek zostały usunięta a filtraty przepłukano w obecności medium hodowlanego (450 g, 10 min). Tak uzyskany pellety komórek zostały zawieszone w 40% Percoll’u. Komórki mononuklerne zostały wyizolowane poprzez nawarstwienie próbek na 60% Percoll’u i wirowaniu (900 g,
22°C, 20 min, bez hamulców). 40 i 60% stężenia Percoll’u uzyskano poprzez proporcjonalne wymieszanie 100% wyjściowego roztworu Percoll’u (1 ml Hank’s balanced salt solution na każde 9 ml roztworu podstawowego gradientu gęstości) z medium hodowlanym, suplementowanym 10% dodatkiem FCS. Po wirowaniu,
kożuszek komórek mononuklearnych przepipetowywano do sterylnych probówek i płukano dwukrotnie w obecności zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS, Sigma-Aldrich, Niemcy) z 5 % dodatkiem FCS. Ostatecznie uzyskane komórki zawieszano w 1 ml PBS i dla idywidualnych próbek wyliczano
liczebność komórek oraz ich żywotność z wykorzystaniem automatycznego licznika komórek Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer (Beckman Coulter, USA).
1 x 106 komórek mononuklearnych z próbek krwi oraz analizowanych narządów przetransferowano do probówek cytometrycznych i wybarwiano przeciwciałami monoklonalnymi Mouse anti chicken CD4:FITC (klon 2-35, Serotec, UK), Mouse anti Chicken CD8a (klon 11-39, Serotec, UK) oraz poliklonalnymi Goat Anti Chicken IgM:FITC (Serotec, UK). Po 30 minutach inkubacji (na lodzie, w ciemności), komórki płukano dwukrotnie w obecności 3 ml PBS. Analizę cytometryczną wykonano z wykorzystaniem cytometru przepływowego BD FACS Canto II (BD Biosciences, USA). Akwizycję danych wykonano z wykorzystaniem oprogramowania
BD FACSDiva wersja 6.1.3 (BD Biosciences, USA) a ostateczną analizę danych z wykorzystaniem oprogramowania
FloJo V10 (Tree Star Ins, USA).
Analiza statystyczna
Wyniki doświadczeń opracowano statystycznie w programie Statistica PL V10, stosując moduły statystyki opisowe oraz test nieparametryczny dla próbek niezależnych U Mann – Whitney’a. Za statystycznie istotne uznano różnice na poziomi istotności p<0,05, a za wysoce istotne przy p<0,01.
Wyniki
Procentowy udział subpopulacji CD4+, CD8+ i CD4+CD8+ limfocytów T oraz subpopulacji IgM+ komórek B w torbie Fabrycjusza, grasicy, migdałkach jelit śllepych, jelicie biodrowym, śledzionie i krwi u kurcząt broilerów i indyków, którym przez 3 dni podawano z wodą do picia badany preparat adiSalmoSOL PF przedstawiono w tabelach 1 i 2.
Z danych zawartych w tabeli 1 wynika, że u kurcząt broilerów, które otrzymywały badany preparat stwierdzono statystycznie istotnie wyższy odsetek subpopulacji CD4+ limfocytów T izolowanych z migdałków jelit ślepych i śledziony, a CD8+ z grasicy i śledziony oraz CD4+CD8+ z Torby Fabrycjusza i błony śluzowej jelita biodrowego. W błonie śluzowej jelita biodrowego kurcząt grupy badanej stwierdzono także wyższy odsetek subpopulacji
IgM+ komórek B. Natomiast u indyków (tabela 2) grupy badanej stwierdzono statystycznie istotnie wyższy odsetek subpopulacji CD4+ limfocytów T izolowanych z grasicy i śledziony., CD8+ izolowanych z migdałków jelit ślepych i krwi oraz CD4+CD8+ izolowanych z grasicy. Nie wykazano różnic statystycznie istotnych między grupą kontrolną a badaną indyków w odsetku subpopulacji IgM+ limfocytów B izolowanych z badanych narządów.
Poziom przeciwciał w surowicy kurcząt broilerów, którym podawano z wodą do picia badany preparat adiSalmoSOL PF przez 3 dni przed lub po szczepieniu przeciwko IBV zestawiono w tabeli 3. Pomimo braku różnic statystycznie istotnych najwyższe miano przeciwciał stwierdzono w grupie kurcząt, które otrzymywały badany preparat po szczepieniu. Najniższe miano przeciwiciał przeciwko wirusowi IB stwierdzono u keurcząt grupy kontrolnej, które nie otrzymywały preparatu adiSalmoSOL PF.
Dyskusja
Pomimo tak częstego stosowania w chowie ptaków różnych preparatów zawierających fitoncydy, które zgodnie z zaleceniami producenta zamieszczonymi w ulotkach działają immunomodulująco, to jednak w dostępnym piśmiennictwie brak jest prac, w których publikowane są wyniki otwierdzające te stwierdzenia. W świetle powyższego podjęto badania własne, których celem
było określenie wpływu fitoncydów zawartych w preparacie adiSalmoSOL PF na wybrane parametry odporności komórkowej u kurcząt broilerów i indyków rzeźnych oraz na poziom przeciwciał po szczepieniu kurcząt przeciwko wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli.
Badany preparat podawano z wodą do picia, zatem mógł on mieć wpływ na funkcjonowanie struktur układu odpornościowego związanych z błonami śluzowymi przewodu pokarmowego
(GALT – gut associated lymphoid tissue). Elementami składowymi GALT są zarówno niżej zorganizowane skupiska komórek limfatycznych, znajdujących się w utkaniu śródnabłonkowym
oraz głębiej leżącej blaszce właściwej błony śluzowej, jak również wyżej uorganizowane struktury limfatyczne jak uchyłek Meckel’a, kępki peyera (PP,, ang. Peyer’s patches) czy migdałki jelit ślepych
(CT) (20). Struktury te stanowią miejsca stałej kooperacji pomiędzy komórkami immunokompetentnymi i odpowiedzialne są zatem za indukcje lokalnych mechanizmów odpornościowych błony śluzowej przewodu pokarmowego. Dodatkowo komórki
limfatyczne współtworzące te struktury są funkcjonalnie związane ze szpikiem kostnym oraz śledzioną (20, 26, 27) co wskazuje na możliwość inicjowania odporności ogólnoustrojowej lokalnie
na terenie przewodu pokarmowego i GALT. Potwierdzono to we wcześniejszych badaniach (23) w których wykazano, że stosowanie różnych stężeń pełnego ziarna pszenicy w mieszance paszowej
dla indyków wpływa na poziom odporności humoralnej po szczepieniu ptaków przeciwko ND oraz TRT jak również odporność komórkową, co określono na podstawie analizy procentowego
udziału różnych subpopulacji limfocytów T we krwi, błonie śluzowej jelita biodrowego oraz w migdałkach jelit ślepych.
Z prezentowanych wyników badań wynika, że fitoncydy zawarte w preparacie adiSolmoSOL PF, podawane z wodą do picia w dawce 1 ml na 1 litr wody przez 3 dni istotnie wpływają na procentowy udział subpopulacji CD4+, CD8+ i CD4+CD8+ limfocytów T oraz subpopulacji IgM+ komórek B izolowanych z torby Fabrycjusza, grasicy, migdałków jelit ślepych, błony śluzowej jelita biodrowego, śledziony i krwi kurcząt broilerów i indyków. Większy odsetek subpopulacji limfocytów T CD4+ i B IgM+ dowodzi, że pod wpływem badanego preparatu dochodzi do wzmagania inicjowania i regulacji odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty te wytwarzają głównie IL-4 i IL-13 oraz IL-3, które są czynnikami wzrostu i różnicowania limfocytów B i wspomagają szczególnie odpowiedź typu humoralnego podczas zakażeń patogenami zewnątrzkomórkowymi (20, 28). Pomimo braku różnic statystycznie istotnych podobne zjawiska zaobserwowano w badaniach i innymi mikroorganizmami oraz nowotworowych, a także hamowanie replikacji wirusów poprzez wydzielanie specyficznych cytokin, np. IFN-γ (20, 28). Warto dodać,że Martinez i wsp. (7) wykazali, iż olejki eteryczne, zwłaszcza oregano, cynamonu, krzewu herbacianego, goździka, rozmarynu i eukaliptusa hamują wzrost na podłożach sztucznych bakterii E.coli, Salmonella spp. oraz Staphylococcus aureus.
Uzyskane wyniki badań własnych wskazują, że badany preparat adiSalmoSOL PF stosowany per os przez 3 dni w dawce 1 ml na 1 litr wody wykazuje działanie immunomodulujące u kurcząt broilerów i indyków.
